研究背景：
肠缺血再灌注(IIR)损伤与高死亡率相关，并发生在许多临床病理中，包括小肠扭转、急性肠系膜缺血、休克和创伤。大量上皮细胞死亡是肠黏膜屏障功能障碍的主要原因，进而导致全身炎症和远端器官功能障碍。而且，IIR引起的严重肠道损伤可能导致远端器官(如肺、肝)的急性损伤，对预后起着至关重要的作用。最近，越来越多的研究表明IIR损伤事件涉及非凋亡途径(例如，坏死性死亡，焦亡和铁死亡。）急性肺损伤(ALI)在危重病研究领域越来越受到重视，其病死率约为50%。核因子红系2相关因子2(Nrf2)是细胞内氧化稳态的关键调节因子，也起抗氧化剂的作用。据报道，Nrf2相关的抗氧化应激与抑制铁死亡密切相关。信号转导和转录激活因子3(STAT3)被激活为磷酸化的STAT3(pSTAT3)，以响应组织损伤，并作为增强炎症反应的警告信号。
在这项研究中，作者假设铁死亡参与了IIR诱导的ALI(IIR-ALI)，并且缺血期间抑制Nrf2通过STAT3信号传导导致再灌注后铁死亡。作者试图阐明STAT3是否可以通过调节SLC7A11来减轻IIR-ALI中的铁死亡。本研究旨在为IIR-ALI的治疗提供新的思路和靶点。
研究结果：
为了验证铁死亡的存在及其在IIR-ALI中的作用，作者确定了抑制铁死亡是否可以挽救IIR-ALI。首先，在IIR-ALI模型中检测肺组织中铁和亚铁的内源性水平。作者发现，与假手术组相比，IIR组的总铁、Fe2+和Fe3+显著增加(图1(a))。铁调素-1是一种特异性铁调素抑制剂，此前已被证明可减轻胰岛素抵抗损伤，对小鼠进行给药，以确定铁调素抑制在胰岛素抵抗损伤中的作用。通过HE染色和W/D实验(图1(b)和2(d))证明，铁抑制素-1对体内铁死亡的抑制显著减轻了肺上皮细胞损伤和肺通透性。肺组织的湿干比在IIR后有所增加，而铁(15毫克/千克)和铁1(5毫克/千克)的施用可分别相应地增加和减少该比值(图1(d))。一些核心因子(如丙二醛和谷胱甘肽)被认为是调节铁缺乏症的关键和有效的代谢指标。细胞内重要的抗氧化因子GSH在IIR模型中降低，且随着铁的加入降低更为明显；然而，在加入Fer-1后，这种减少减轻了(图1(e))。此外，脂质过氧化产物丙二醛在IIR模型中增加，在添加铁后更明显，在添加Fer-1后减少(图1(f))。线粒体嵴的减少或消失是铁死亡的特征性指标。因此，作者接下来使用透射电子显微镜来研究铁下垂的形态学特征。作者观察到，与假手术组相比，IIR组小鼠肺泡上皮细胞的线粒体形态发生了铁死亡的特征性变化，包括线粒体变小和嵴减少(图1(g))。此外，在IIR模型中，GPX4(一种与脂质过氧化相关的关键铁死亡因子[14])的表达显著降低。这种减少在铁组中更为显著，在铁-1组中得到恢复(图1(h))。因此，这些发现表明铁死亡发生在IIR-ALI中。
Nrf2是抗氧化应激的重要调节因子；作者发现，在IIR模型中，Nrf2的表达显著增加。铁组的这种增加更为严重，在施用Fer-1后恢复(图2(a))。为了进一步探索Nrf2在铁死亡和IIR-ALI中的作用，作者使用Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)小鼠。作者发现在IIR模型中GPX4的表达显著降低。这种减少在NRF2-/-组中更为显著(图2(b))。此外，作者还检测了谷胱甘肽和丙二醛的水平。结果显示，在IIR模型中GSH减少，并且在NRF2-/-组中减少更明显(图2(c))，并且脂质过氧化产物MDA在IIR后的NRF2-/-组中增加更严重(图2(d))。透射电镜观察到Nrf2-/-IIR组线粒体体积缩小，嵴减少或消失，外膜破裂，提示Nrf2可减轻铁死亡(图2(e))。这一发现也与先前的研究一致，表明Nrf2在ALI中起保护作用。有趣的是，作者发现Nrf2可能通过抑制铁死亡来缓解ALI。
为了进一步探讨Nrf2是否在铁调亡介导的IIR-ALI中调节STAT3，使用了Nrf2基因敲除小鼠。分别对四组小鼠的肺组织进行逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹。RT-PCR结果显示，与WT小鼠相比，NRF2-/-小鼠STAT3的mRNA水平显著增加(图3(a))。尽管STAT3总蛋白水平没有变化，但与四组WT小鼠相比，NRF2-/小鼠STAT3磷酸化显著增加，表明STAT3抗氧化途径被激活(图3(b)和3(c))。类似地，分别给予铁和Fer-1后，上述三种蛋白质的表达可以增加和减少(图3(b))。此外，敲除Nrf2后SLC7A11下调(图3(b)和3(d))。
为了研究铁死亡在OGD/R诱导的MLE12细胞体外死亡中的相对作用，作者测量了在存在或不存在各种铁死亡抑制剂或铁下垂促进剂的情况下，OGD8小时和复氧12小时后的细胞存活率。作者的分析显示，在施用毫克/毫升铁(一种铁死亡促进剂)后，细胞存活显著恶化(图4(a))。相比之下，在剂量为0.1μM时，施用铁死亡抑制剂Fer-1显著降低了OGD/雷氏病诱导的死亡率(图4(a))。作者还评估了OGD/R模型后谷胱甘肽(图4(b))和丙二醛(图4(c))的水平。与IIR模型一致，OGD/R模型中谷胱甘肽降低。虽然加入铁后还原更明显，但加入Fer-1后还原减轻(图4(b))。同样，OGD/R后MDA水平升高，添加Fe后升高更明显，添加Fer-1可降低MDA水平(图4(c))。OGD/R后GPX4表达水平降低，Fe组降低更显著，Fer-1组恢复(图4(d))。Nrf2的表达在OGD/R模型中增加，在Fer-1组中可以恢复。这些结果表明，OGD/R诱导的细胞死亡与铁死亡有关，并且可以通过用铁死亡抑制剂治疗来抑制。
pSTAT3激活和抑制剂可通过调节SLC7A11分别改善和加重OGD/R诱导的MLE12铁死亡。与体内研究结果相似，在OGD/瑞替尼治疗后，MLE12细胞中pSTAT3和SLC7A11蛋白表达水平增加，并且在铁(μg/mL)给药后显示出增加的严重程度。相反，在施用Fer-1(0.1μM)后，pSTAT3和SLC7A11的水平与OGD/R组相比有所降低(图5(a))。然后作者研究了STAT3(pSTAT3)的激活是否可以改善OGD/R诱导的MLE12细胞损伤。在MLE12细胞中使用static(pstat3的药物抑制剂)会加重OGD/R诱导的MLE12细胞损伤(图5(b))，并下调SLC7A11(图5(c))。此外，治疗大肠杆菌素(pSTAT3的药物激活剂)可以减轻OGD/R诱导的MLE12细胞损伤(图5(d))，并上调SLC7A11(图5(e))。这些发现表明STAT3的激活可能在急性肺损伤中起保护作用。
Nrf2介导的STAT3激活改善OGD/rin诱导的MLE12铁死亡。为了研究Nrf2和STAT3是否可以通过调节OGD/R中的SLC7A11抑制铁死亡，使用慢病*敲除或过量表达Nrf2。结果显示，用shRNA慢病*下调Nrf2显著加重了GPX4水平的降低和STAT3磷酸化的增加，以抵抗细胞损伤(图6(a))。此外，Nrf2的过表达减轻了GPX4水平的降低和STAT3磷酸化的减弱(图6(b))。这些数据表明，Nrf2可以调节STAT3的激活以抵抗铁死亡，并在OGD/R诱导的铁死亡中起保护作用。
STAT3下调SLC7A11并加重OGD/格林诱发的MLE12铁死亡。为了进一步阐明STAT3的激活是否有助于抗铁死亡，作者使用shRNA慢病*敲除MLE12细胞中STAT3的表达。结果显示，STAT3干扰显著降低了STAT3的水平，下调了SLC7A11的表达，尽管pSTAT3/STAT3没有显著变化(图7(a))。结果，作者发现细胞死亡比用NC慢病*转染的MLE12细胞中观察到的更严重(图7(b))。此外，STAT3干扰显著增加了GPX4(图7(e))和谷胱甘肽(图7(c))的降低水平。在OGD之后，丙二醛水平(图7(d))有了更大程度的增加。
STAT3过表达上调SLC7A11和改善OGD/R诱导的MLE12铁死亡。此外，作者使用过表达STAT3的慢病*过表达STAT3。虽然SLC7A11和pSTAT3的水平在正常条件下没有增加，并且pSTAT3/STAT3的百分比在不同组中没有变化；OGD/R模型后，它们的蛋白表达水平增加(图8(a))。随着磷酸化STAT3和SLC7A11的增加，OGD/R引起的细胞损伤显著减少(图8(b))。此外，STAT3过表达减轻了OGD/R后GPX4(图8(e))、GSH(图8(c))和MDA(图8(d))水平的降低。这些结果共同表明STAT3激活调节SLC7A11抑制铁死亡，并在OGD/R诱导的铁死亡中起保护作用。
结论：
综上所述，作者证实了铁死亡与肠IR损伤的关系，并揭示了铁抑制素-1通过抑制铁死亡来防止IR损伤并恢复肺上皮屏障功能。Nrf2和STAT3共同调节SLC7A11以减轻IIR-ALI中的铁死亡。未来的研究将集中在Nrf2和STAT3对铁死亡的干扰，并将抑制策略扩展到IIR-ALI治疗。
Thankyou！
扫码